В 1935 году в Хопёрском заповеднике насчитывалось 39 видов млекопитающих. За прошедшее время список увеличился до 44 видов. Например, лось, европейская косуля, благородный олень, кабан, волк, барсук, лесная куница, лесной хорь, заяц-русак, белка, лесная соня, белогрудый еж и другие. Это типичные представители для зоны широколиственных лесостепных лесов Европы, проживающие на границе лесостепной и степной зон. Заповедник принимал участие в проекте по восстановлению европейского зубра. На территории с 1956 по 1980 года содержалось стадо 25-30 зубров и зубробизонов. В наши дни на территории заповедника их нет.
В заповеднике богатая орнитофауна. Здесь обитает 230 видов птиц. В 1998 году организацию включили в программу «Ключевые орнитологические территории России» (KOTR). На территории заповедника обитают: серая цапля, орлан-белохвост, зимородок обыкновенный, степной лунь, большой подорлик, дупель.
Наряду с зверями и птицами, в заповеднике обитают 9 видов земноводных и 9 видов пресмыкающихся. К числу наиболее многочисленных видов следует отнести краснобрюхую жерлянку, обыкновенную чесночницу, озерную, прудовую и остромордую лягушек, болотную черепаху, ящерицу прыткую и гадюку Никольского, которая занесена в Красную книгу РФ. Более редкими видами считаются медянка обыкновенная, живородящая ящерица, веретеница ломкая, гребенчатый тритон.
Ихтиофауна насчитывает 42 вида рыб, из них 32% вида занесены в Красные книги разных уровней. В водоемах встречаются стерлядь, налим, сом, лещ, судак, жерех, чехонь и другие.